常用体外诊断试剂的基本原理

按照检验方法，临床诊断试剂大致可分为临床生化检测试剂、免疫学和血清学检测试剂血液学及细胞遗传学检测试剂、微生物学检测试剂、体液排泄物及脱落细胞的检测试剂、分子生物学诊断试剂等种类。我们就其中主要的临床生化、免疫学、细胞学和基因诊断试剂的基本原理进行阐述。

发光酶免疫分析法  从标记免疫分析角度看化学发光酶免疫分析（chemiluminescent enzyme immunoassay, CLEIA）,应属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同：以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣跟过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。发光试剂HRP标记的CLEIA常用的底物为鲁米诺（32-氨基邻苯二甲酰肼），是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧（过氧化阴离子、单线态氧、羟自由基、过氧化氢）存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。早期用鲁米诺直接标记抗原（或抗体），但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和启动发光试剂（NaOH?2H2O2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak  Am  erliteTM半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。增强发光酶免疫分析（enhanced  luminescence  enzyme  immunoassay, ELEIA）在发光系统中加入增强发光剂，如对二碘苯酚等，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上，还可通过计算机严密控制，进行自动操作，如加试剂、混合、温育、洗涤、加发光试剂，发光计数，数据处理，绘制标准曲线，直至完成患者血清样品的分析并打印出结果。AmerliteTM增强发光酶免疫分析系统用荧光素、噻唑等增强剂，其发光时间可持续长达20min,试剂盒有检测甲状腺功能的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素，与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮以及其它方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。

ALP标记的CLEIA所用底物为环1，22-二氧乙烷衍生物，这是一类很有前途的发光底物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基因——金刚烷基，其分子中发光基团为方香基团和酶作用的基团，在酶及启动发光试剂作用下引起化学发光。常使用的底物是AMPPT[32(2’,2-spiroadaman-2-tane)42-methoxy-242(3’,2-phosphoryloxy)-2-phenyl-21,22-dioxetane]，中文名为：32（2’ ，2-螺金刚烷）-242甲氧基-242(3’,2- 磷酰氧基)-2-苯基-21，22-环二氧乙烷）。在碱性磷酸酶（ALP）作用下，磷酸酯基发生水解而脱出一个磷酸基，得到一个中等稳定的中间体AMPD（半寿期为2～30min）,此中间体经分子内电子转移裂解为1分子的金刚烷酮和1分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当期回到基态时产生470nm的光，可持续数十分钟。AMPPD为磷酸酯酶的直接化学发光底物，可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其他配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10～15mol/L。