微生物的分离是指将目标菌种从微生物群体（尤其是不同微生物群体）中分离出来的技术，是微生物实验基础，也是嘉兴无菌检验员培训学员必须要掌握的内容。微生物的分离培养方法主要有三种：划线分离法，涂布平板法和倾注平板法。本文先为大家说说涂布平板法。

嘉兴无菌检验员培训之涂布平板法

1.定义：

待分离微生物样品经过一系列梯度（一般10倍递增）稀释后，使微生物菌体充分分散，成为单细胞，然后再取出一定量，涂布到固体培养基表面的方法，再经过适宜的培养条件，形成单菌落的过程。

2.目的：

(1)获得纯培养物-目标菌。

(2)获得纯培养在微生物杂菌中的数量或比例—平板计数。

3.梯度稀释步骤：

(1)称量：准确称取待测样品1g或量取待测样品1mL。

(2)稀释：将上述样品放入装有99mL无菌生理盐水（有小玻璃珠）的250mL三角瓶中，记录。

(3)摇匀：将上述三角瓶放置于摇床上振荡30min，使微生物细胞充分分散，静置20-30s，即成10-2稀释液。

(4)继续稀释：再用1mL无菌移液器，吸取上述稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液和水混合均匀，即成10-3稀释液。

(5)继续稀释：再换一支无菌移液器，吸取10-3稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，即成10-4稀释液。

(6)继续稀释：以此类推，连续梯度稀释，制成10-7、10-8、10-9 等一系列稀释菌液。

4.涂布平板步骤：

(1)标记：将事先制备好的无菌平板上标记10-7、10-8、10-9，每一个梯度稀释设置三个重复。

(2)涂布：用无菌移液器分别吸取10-7稀释液0.1mL放入编号10-7的3个平板中，然后用涂布棒或涂布器将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个涂布器，用完涂布器酒精灯灼烧灭菌。

(3)继续涂布：同样涂布10-8稀释液和10-9稀释液，切记更换涂布棒。

(4)培养：将涂布好的平板平放于超净台上静置10min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板放置于恒温培养箱中倒置培养。

(5)计数：至长出菌落后即可计数。

(6)保存：将单菌落平板储存至4℃保存。

5.计数原则：

(1)计数原则，平板上菌落数30-300个为合格。

(2)如果只有一个稀释度的平均菌落数，则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL)，乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数。

(3)如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求，则按照两者菌落总数之比来决定，如果小于2，取两者的平均值如果大于2，取较小的菌落总数。

6.操作技巧：

(1)前几个稀释梯度，尤其是第一个梯度适当放大稀释倍数。

这样不容易丢失目标菌，也可以很好地对样品进行溶解。

(2)学会使用玻璃珠。

玻璃珠的作用是研磨，尤其是粉末或颗粒性样品，可以将颗粒表面微生物与液体充分接触。

(3)勤换枪头或移液管。

这样不容易造成不同稀释度间混乱，防止不同梯度间取样不准。

(4)一定要摇匀。

平板涂布法的难点就在于稀释，稀释不准确后面一切都化为零，一定要摇匀再取样。

(5)利用显微镜粗略估测稀释倍数。

并不是每一个样品都需要稀释到10-9，而是要根据样品中微生物的数量进行稀释。

(6)涂布完成后，静置10min再倒置培养。

静置有利于微生物在培养基表面吸附，直接倒置培养，可能倒置菌液向一侧流动。

(7)倒固体培养基的时候，可以适当吹干或提前一到两天倒平板。

平板表面没有多余水分且比较湿润，涂布时候既容易涂开也不会造成出现菌苔。

7.注意事项：

(1)注意涂布力度，大小适宜，不应划破培养基的表面。

(2)如果发现平板上水太多，处理后再使用。

(3)切记写清楚标记。

(4)试验完毕，注意灼烧涂布器，以免影响环境，造成交叉污染。

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